微生物转化虎杖中白藜芦醇苷及其产物的分离纯化
【摘要】：中药虎杖是蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)的根和茎,具有祛风利湿,散瘀定痛,止咳化痰等功效。白藜芦醇是虎杖中最有价值的成分,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗癌等功效,现已广泛应用在食品添加剂、保健品、化妆品等行业。但是白藜芦醇的含量偏低,加大了其生产成本。白藜芦醇的糖苷化合物白藜芦醇苷和白藜芦醇具有相似的药理作用,其含量远高于白藜芦醇,但其生物利用度远低于白藜芦醇。将糖苷转化为其苷元通常由酸水解或碱水解来实现。但是反应需要高温高压等剧烈条件,不仅对设备要求高,而且对环境造成很大的污染。相比之下,生物转化法条件温和,操作简单,成本低廉,环境友好。本文利用生物转化法直接将虎杖粗药材中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇,并对其分离纯化工艺进行了研究。首先,筛选β-葡萄糖苷酶的高效产生菌食品级微生物米曲霉,对其所产β-葡萄糖苷酶的性质进行了研究,并用此酶液对虎杖粗药材中的白藜芦醇苷进行转化。结果表明,该β-葡萄糖苷酶的最适pH值为4.8,最适温度为50℃。用β-葡萄糖苷酶粗酶液对虎杖粗药材中的白藜芦醇苷转化12小时,体系中白藜芦醇苷的转化率达100%,白藜芦醇的含量提高到原来的2.9倍。在此基础上,用米曲霉直接将虎杖粗药材中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇,并对其转化机理进行了研究。摇瓶发酵46小时使白藜芦醇苷完全转化为白藜芦醇,白藜芦醇的提取百分率提高到1.36%,是微波辅助提取的3.6倍。商品纤维素酶水解粗药材12小时后达到了同样高的提取百分率,但是酶的昂贵价格限制了其工业应用。酸水解粗药材20分钟可以将79.0%的白藜芦醇苷水解为白藜芦醇,但同时46.7%的白藜芦醇在此过程中被破坏,因此酸水解不是一种可行的策略。相比较而言,微生物转化法条件温和,操作简单,产物收率高,具有很大的工业化潜力。因此,在摇瓶发酵的基础上对菌种进行驯化,并用5L发酵罐进行发酵工艺的放大与优化。结果表明,在温度为37℃,通气量为1.5vvm下发酵20小时后,将温度升高到50℃继续反应2小时,白藜芦醇苷的转化率达105%,白藜芦醇的浓度提高到原来的3.4倍,达到了文献报道的自然发酵72小时的水平。转化机理研究表明,白藜芦醇和白藜芦醇苷以游离状态存在于药材细胞中,发酵过程中白藜芦醇苷被转化为白藜芦醇,同时药材细胞壁上的纤维素被部分水解,从而有利于产物的提取。其次,以乙醇/硫酸铵双水相体系为溶剂,利用微波辅助双水相提取分别从虎杖粗药材和虎杖发酵液中提取了白藜芦醇苷、白藜芦醇和大黄素,并对其分相行为进行了研究。选择25%(w/w)的乙醇和21%(w/w)的硫酸铵为提取剂从虎杖粗药材中提取所得的白藜芦醇苷和加热回流与微波辅助提取的提取率相等,而白藜芦醇和大黄素的提取率分别为微波辅助提取和加热回流提取的1.1倍和1.9倍。选择此双水相体系对虎杖发酵液进行提取,所得的白藜芦醇和大黄素的提取率分别是微波辅助提取的1.2倍和3.3倍,分别是常温搅拌提取的1.6倍和4.2倍。发酵液提取物中白藜芦醇和大黄素的含量分别为微波辅助提取的1.3倍和2.3倍,分别为常温搅拌提取的1.4倍和2.6倍,而葡萄糖和多糖的含量分别为后两者的27%和79%。微波辅助双水相提取同时具备微波辅助提取和双水相萃取的优点,并把两个操作步骤合为一步,提高了收率,降低了成本。因此,是一种很有前景的提取和分离目标产物的方法。最后,利用大孔树脂结合聚酰胺柱层析从发酵液提取物中纯化白藜芦醇,并测定了大孔树脂和聚酰胺对白藜芦醇的吸附动力学参数。结果表明,大孔树脂和聚酰胺对白藜芦醇的表观静态吸附量分别为11.70mg/g和57.90mg/g,表观动态吸附量分别为12.47mg/g和58.98mg/g,吸附均符合Langmuir吸附特征。利用大孔树脂结合聚酰胺柱层析两步纯化发酵液中的白藜芦醇,使其纯度达到95.8%,总收率达69.8%。同时,提取液中的大黄素得到回收,其纯度为18.6%,收率为84.2%。此方法操作简单,成本低廉,白藜芦醇的纯度和收率高,有良好的工业化应用前景。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：TQ461
【目录】：
· 摘要4-6
· Abstract6-12
· 引言12-14
· 1 文献综述14-40
· 1.1 天然药物的生物转化14-19
· 1.1.1 酶法转化15-16
· 1.1.2 动植物细胞转化16
· 1.1.3 微生物转化16-18
· 1.1.4 展望18-19
· 1.2 天然产物的分离纯化技术19-30
· 1.2.1 微波辅助提取19-23
· 1.2.2 双水相萃取23-25
· 1.2.3 大孔树脂柱层析25-27
· 1.2.4 聚酰胺柱层析27-30
· 1.3 白藜芦醇30-39
· 1.3.1 白藜芦醇的药理作用30-31
· 1.3.2 白藜芦醇的分析与鉴定方法31-33
· 1.3.3 白藜芦醇的提取方法33-36
· 1.3.4 白藜芦醇的纯化技术36-38
· 1.3.5 生物转化法获取白藜芦醇的研究进展38-39
· 1.4 本论文研究思路39-40
· 2 白藜芦醇苷酶法转化为白藜芦醇40-56
· 2.1 引言40-41
· 2.2 材料与方法41-46
· 2.2.1 主要仪器与试剂41
· 2.2.2 分析方法41-44
· 2.2.3 菌种筛选44-45
· 2.2.4 产酶培养基的选择45
· 2.2.5 β-葡萄糖苷酶的制备45
· 2.2.6 β-葡萄糖苷酶的性质45
· 2.2.7 酶法转化白藜芦醇苷为白藜芦醇45-46
· 2.3 实验结果46-54
· 2.3.1 β-葡萄糖苷酶高活力菌株的筛选46-47
· 2.3.2 虎杖浓度对β-葡萄糖苷酶活力的影响47-48
· 2.3.3 β-葡萄糖苷酶的最适pH值与热稳定性48-51
· 2.3.4 酶法转化白藜芦醇苷为白藜芦醇51-54
· 2.4 讨论54-55
· 2.5 小结55-56
· 3 白藜芦醇苷微生物转化为白藜芦醇56-72
· 3.1 引言56
· 3.2 材料与方法56-59
· 3.2.1 主要仪器与试剂56-57
· 3.2.2 分析方法57
· 3.2.3 虎杖粗药材的摇瓶培养57-58
· 3.2.4 菌种的驯化58
· 3.2.5 批式发酵工艺58
· 3.2.6 转化机理的研究58-59
· 3.3 实验结果59-69
· 3.3.1 摇瓶培养59-63
· 3.3.2 温度和通气量对微生物转化的影响63-69
· 3.3.3 转化机理的探讨69
· 3.4 讨论69-71
· 3.5 小结71-72
· 4 微波辅助双水相提取白藜芦醇72-96
· 4.1 引言72-73
· 4.2 材料与方法73-77
· 4.2.1 主要仪器与试剂73
· 4.2.2 分析方法73-74
· 4.2.3 微波辅助提取虎杖中的白藜芦醇74-75
· 4.2.4 微波辅助双水相提取虎杖中的白藜芦醇75-77
· 4.2.5 微波辅助双水相提取虎杖发酵液中的白藜芦醇77
· 4.3 实验结果77-94
· 4.3.1 微波辅助提取虎杖中的白藜芦醇77-83
· 4.3.2 微波辅助双水相提取虎杖中的白藜芦醇83-93
· 4.3.3 微波辅助双水相提取虎杖发酵液中的白藜芦醇93-94
· 4.4 讨论94-95
· 4.5 小结95-96
· 5 白藜芦醇的分离纯化工艺96-116
· 5.1 引言96
· 5.2 材料与方法96-100
· 5.2.1 主要仪器与试剂96-97
· 5.2.2 分析方法97
· 5.2.3 提取液的制备与预处理97-98
· 5.2.4 大孔树脂柱层析纯化白藜芦醇98-99
· 5.2.5 聚酰胺柱层析纯化白藜芦醇99-100
· 5.2.6 大孔树脂结合聚酰胺柱层析纯化白藜芦醇100
· 5.2.7 大黄素的回收100
· 5.3 实验结果100-114
· 5.3.1 提取液的预处理条件对产物收率的影响100-103
· 5.3.2 大孔树脂柱层析纯化白藜芦醇103-108
· 5.3.3 聚酰胺柱层析纯化白藜芦醇108-113
· 5.3.4 大孔树脂结合聚酰胺柱层析纯化白藜芦醇113-114
· 5.3.5 大黄素的回收114
· 5.4 讨论114-115
· 5.5 小结115-116
· 结论116-118
· 展望118-119
· 创新点摘要119-120
· 参考文献120-128
· 攻读博士学位期间发表学术论文情况128-129
· 致谢129-130
· 作者简介130-131
